利用單分子光鉗直接量測mRAD51組裝至DNA之複合體單元大小

張晏展

doi:10.6342/NTU201903151

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利用单分子光钳直接量测mRAD51组装至DNA之复合体单元大小

Direct Observation of Mouse RAD51 Assembly Unit Using Optical Tweezers

张晏展 , 硕士　　导师：李弘文　　

繁体中文 DOI： 10.6342/NTU201903151

RAD51 ； SWI5-SFR1 ； BRC4 ；单分子生物物理；光钳； RAD51 ； SWI5-SFR1 ； BRC4 ； single-molecule biophysics ； optical tweezers

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摘要 │ 参考文献 (40) │ 国际计量

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Recombinases are shown to form closed-ring (hexameric to octameric) structure in electron microscopic studies, but direct structural evidence in solution is missing. We used the passive force-clamp optical tweezers to directly observe the existence of oligomeric recombinase nucleoprotein filament assembly in real-time. To achieve sufficient resolution to resolve individual steps during filament assembly, several instrumental improvements and programming developments have been achieved: (1) improved our home-built optical tweezers stability by using a circuit-based laser feedback to reduce laser power fluctuation; (2) improved the precision and accuracy of trap stiffness calibration by using three independent methods; (3) developed an automatical program to implement passive force clamp; (4) used Allan deviation to validate passive force clamp. Our improved instrument can achieve 1 nm precision in 100 ms using force-activated DNA (a DNA contain 4178 bp dsDNA and 1002 nt ssDNA). We used this improved passive force-clamp optical tweezers to directly observe the assembly dynamics of mouse RAD51 nucleoprotein filament in real-time. Stepwise extension is observed with a single-exponentially distributed dwell between continous extension. Analysis showed that mRAD51 mostly assemble in octamers. Adding accessory proteins, mSWI5-SFR1 complex reduces the assembly unit from octamers to tetramers. Including a short peptide of BRCA2 protein, BRC4, also reduces to tetramers. This reduction in assembly unit is accompanied by increase in extension rates. Our results suggest that the stimulation of mRAD51 filament assembly by mSWI5-SFR1 and mBRC4 are resulted from reduing the assembly unit and increasing the affinity of mRAD51 to DNA.

参考文献 ( 40 ) 〈TOP〉

1. Yu, X.; Egelman, E. H., The RecA hexamer is a structural homologue of ring helicases. Nat. Struct. Biol. 1997, 4 (2), 101-104.
2. Yang, S., et al., Archaeal RadA protein binds DNA as both helical filaments and octameric rings11Edited by M. Belfort. J. Mol. Biol. 2001, 314 (5), 1077-1085.
3. Shin, D. S., et al., Full-length archaeal Rad51 structure and mutants: mechanisms for RAD51 assembly and control by BRCA2. EMBO J. 2003, 22 (17), 4566-4576.
4. Passy, S. I., et al., Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96 (19), 10684-10688.
5. van der Heijden, T., et al., Real-time assembly and disassembly of human RAD51 filaments on individual DNA molecules. Nucleic Acids Res. 2007, 35 (17), 5646-5657.

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