點帶石斑之Interleukin-6 receptor (IL-6R) 的基因選殖分析及其與Interleukin-6 (IL-6) 融合蛋白的建構與蛋白表現

莊婷淯

doi:10.6342/NTU202003639

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点带石斑之Interleukin-6 receptor (IL-6R) 的基因选殖分析及其与Interleukin-6 (IL-6) 融合蛋白的建构与蛋白表现

The Construction of Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides) Interleukin-6 and Interleukin-6 Receptor Fusion Protein (Hyper-IL-6), Recombinant Protein Expression, and Functional Analysis

庄婷淯 , 硕士　　导师：林翰佑　　

英文 DOI： 10.6342/NTU202003639

点带石斑；介白素-6 ；介白素-6 受体； Hyper-IL-6 ；免疫系统； Epinephelus coioides ； interleukin-6 ； interleukin-6 receptor ； Hyper-IL-6 ； immune system

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摘要 │ 参考文献 (32) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

Interleukin-6 (IL-6) 为一种多效性细胞激素，其在调节免疫反应上占有非常重要的位置。在先天性及後天性免疫反应中，IL-6 可以诱发急性期蛋白、抗菌胜肽、补体等免疫因子分泌，且促使淋巴球的增生及分化并促进抗体的产生。其作用的机制为在目标细胞上，IL-6 会与其受体 interleukin-6 receptor (IL-6R) 及 glycoprotein 130 (gp130) 进行结合，其刺激讯息会藉由 gp130 传递至细胞内，并引起细胞下游免疫反应产生。IL-6 与受体结合在不同的细胞的结合方式有两种，分别为 classic signaling 及trans-signaling，其不同处在於与不同型态的IL-6R 结合。IL-6 与 membrane-form IL-6R (mIL-6R) 结合後再与gp130联合称为classic signaling，而与soluble-form IL-6R (sIL-6R) 结合後再与gp130联合为trans-signaling。当IL-6 进行trans-signaling时有机会提高 IL-6 产生免疫反应的机率。在过去的研究将sIL-6R 与 IL-6 以一段直链蛋白连接，形成一种名为Hyper-IL-6 的融合蛋白。其研究结果显示，若使用Hyper-IL-6 刺激，在达到同样的免疫刺激量时，Hyper-IL-6所使用的剂量比IL-6低100-1000倍。因此， Hyper-IL-6 可能是一个在免疫上极具潜力的融合蛋白。本篇研究将从点带石斑鱼体组织内获取点带石斑mIL-6R 的基因，藉由生物资讯学的方式预测其信号蛋白(signal peptide)，免疫球蛋白结构域 (immunoglobin domain, Ig domain)，细胞激素结合位 (cytokine-binding domains, CBD, 以IL-6R 来说即为IL-6 binding site)，纤连蛋白III型结构域 (fibronectin type III domain, FN 3 domain)，跨膜结构域 (transmembrane domain), WSXWS motif, cysteine residues 等蛋白结构域，并与其他已知IL-6R 的鱼种以及哺乳类的IL-6R 进行比对，以确认获取之基因为IL-6R。根据以生物资讯预测到的跨膜区，从mIL-6R 中取得sIL-6R 的基因後进行密码子优化 (codon usage)，再将优化後的sIL-6R 与 IL-6 以基因工程的方式结合，形成点带石斑之Hyper-IL-6。本研究将 sIL-6R及Hyper-IL-6 进行蛋白表现後，其蛋白纯化，功能性分析及与gp130结合性测试将於未来工作中逐一完成，预计融合蛋白Hyper-IL-6 可以提升鱼体之免疫效益，可以做为未来免疫促进剂或是疫苗佐剂开发的参考。

并列摘要〈TOP〉

Interleukin-6 (IL-6) is a pleiotropic cytokine, which has various effects on innate and acquired immune responses including induce the expression of acute phase proteins (APPs), antimicrobial peptides and complements, promoting antimicrobial activities. When it binds with the specific cognate receptor interleukin-6 receptor (IL-6R) and glycoprotein 130 (gp130), it can activate downstream signaling pathway; there are two different binding type between IL-6, IL-6R and gp130 ‘class-signaling pathway’ was lunched by IL-6 binding the receptor IL-6R and gp130 on the cell membrane of target cell; ‘trans-signaling pathway’ require a soluble IL-6R (sIL-6R) instead of mIL-6R on the target cell surface. In order to increase the effect of IL-6 induced trans-signaling pathway, in previous research, designed a recombinant fusion protein by linking an IL-6, a soluble IL-6R and a flexible peptide linker, and named Hyper-IL-6. It has 100 to 1,000-fold more activity than free form IL-6 and IL-6R. Since Hyper-IL-6’s high immune inducible efficiency, it might be a good candidate protein for immunostimulants or adjuvants of vaccine in teleost. In this study, the Epinephelus coioides (grouper) IL-6R was cloned and IL-6R homologues were identified. Then, the protein and specific domain were defined, including immunoglobulin domain (Ig domain), cytokine-binding domains (CBD, IL-6 binding site), fibronectin type III domain (FN 3 domain), WSXWS motif, cysteine residues. Based on the research in 1997, The combination of the extracellular domain of grouper IL-6R and IL-6 together with a peptide linker was constructed. The functional analyzed and binding assay of Hyper-IL-6 will be confirmed in the future work, and hope that can increasing the immunology effectively enhance in aquaculture.

参考文献 ( 32 ) 〈TOP〉

陈信宏（2011）。点带石斑鱼介白素-6之基因选殖、蛋白表现及功能分析。国立成功大学生物科技研究所硕博士班硕士论文，台南市。[Hsin-Hung Chen (2011). Interleukin-6 gene cloning, protein expression and functional analysis of orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). National Cheng Kung University.]
方苡帆（2013）。应用重组介白素-6於点带石斑鱼之抗病机转研究。国立成功大学生物科技研究所硕博士班硕士论文，台南市。[Yi-Fan Fang (2013). The pathogen resistance mechanism of recombinant interleukin-6 treated grouper (Epinephelus coioides). National Cheng Kung University.]
苏建宏（2015）。在不同免疫刺激下点带石斑其IL-6, IL-6R和gp130的讯息传递。国立成功大学生物科技研究所硕士论文，台南市。[Chien-Hung Su (2015). Gene signaling analysis between IL-6, IL-6R and gp130 in various immune stimulated orange-spotted grouper (Epinephelus coioides). National Cheng Kung University.]
陈俊翰（2015）。不同给药路径给予介白素-6对点带石斑鱼免疫能力促进之评估。国立成功大学生物科技研究所硕士论文，台南市。[Chun-Han Chen (2015). Evaluated the immune stimulated responses in recombinant interleukin-6 treated groupers (Epinephelus coioides) via various administrated routes. National Cheng Kung University.]
Agrawal, A., Cha-Molstad, H., Samols, D., Kushner, I. (2001). Transactivation of C-Reactive Protein by IL-6 Requires Synergistic Interaction of CCAAT/Enhancer Binding Protein β (C/EBPβ) and Rel p50. The Journal of Immunology, 166(4), 2378. doi:10.4049/jimmunol.166.4.2378

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