TSG101蛋白質之穩定性受其剪接變異體作用並藉此影響Epstein-Barr病毒晚期基因的轉錄

蔡慧慧

doi:10.6342/NTU.2007.02071

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TSG101蛋白质之稳定性受其剪接变异体作用并藉此影响Epstein-Barr病毒晚期基因的转录

Stabilization of TSG101 protein by its splice variant and the impact on Epstein-Barr viral late gene transcription

蔡慧慧 , 博士　　导师：蔡锦华　　

英文 DOI： 10.6342/NTU.2007.02071

Epstein-Barr 病毒；晚期基因； Rta ；剪接；转录； Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) ；泛素； Epstein-Barr virus (EBV) ； Late gene ； Rta ； Splicing ； Transcription ； Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) ； Ubiquitin (Ub)

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摘要 │ 国际计量

摘要〈TOP〉

於细胞癌化过程中，其前体信使核糖核酸 (pre-mRNA)之剪接(splicing) 常丧失了正常精确的自我调节能力，以致出现异常剪接 (aberrant splicing)现象；Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) pre-mRNA之剪接即是此过程中常受影响的范例之一。在许多种癌组织细胞中，TSG101 mRNA的表现，除了其全长的TSG101 mRNA外，亦可同时侦测到其它截形(truncated)的TSG101 mRNA同质体 (isoform)；尤其是剪除TSG101核苷酸第154至1054 之mRNA (於後称为TSG101-247)，更是TSG101诸多异常剪接产物中出现频率最高的一员。本研究发现鼻咽癌病理组织亦不例外，我们在其中也侦查到TSG101-247的表现。独特的是，TSG101-247在鼻咽癌细胞株中的表现与EBV的感染息息相关，尤其是EBV进入溶裂期(lytic cycle)时，TSG101-247在该细胞中的表现量较EBV滞留在潜伏期(latent state)者更胜一筹。由基因转染试验显示，EBV 的病毒蛋白质EBNA1，Zta 与Rta会干预TSG101 mRNA的剪接并促成TSG101-247产生。
在功能上，我们发现TSG101-247可增强TSG101蛋白质的稳定性(stability)，其中关键机制在於TSG101-247可抑制TSG101的多次泛素化(polyubiquitination)，进而使TSG101不被蛋白解体(proteasome)分解。TSG101-247此功能需待其转译成蛋白质後方能执行，因若将TSG101-247 的启动密码子(start codon) AUG突变成AAA後，TSG101-247无法转译成蛋白质，其稳定TSG101的能力也随既消失。再者，若将TSG101-247蛋白质上的离氨基酸基(Lysine residue, K)置换成精氨酸(Arginine, R)，使其无法与泛素(ubiquitin, Ub)结合，如此也会导致TSG101-247稳定TSG101的能力丧失。可见TSG101-247蛋白质与Ub的结合能力攸关其是否能稳定TSG101。深入分析，我们发现TSG101-247实与TSG101竞争结合TSG101专属的E3 Ub ligase，称TSG101-associated ligase (Tal)。一旦TSG101-247结合了Tal之後，所引发的结果与TSG101相似---TSG101-247会被多次泛素化。经由此途径，TSG101-247不仅增强了TSG101蛋白质的稳定性，同时亦强化了TSG101在细胞中的机能活性。因表现TSG101-247的细胞，其中TSG101抑制雄性荷尔蒙受体(androgen receptor)活化基因表现以及TSG101刺激癌细胞生长的能力均显着增强。针对EBV而言，我们发现TSG101-247透过强化TSG101蛋白质的稳定性亦可增进EBV晚期基因(late gene)的表现。
有鉴於此，我们开始探究EBV是否利用TSG101来协助其发展溶裂期并产出子代。采用微小核糖核酸干扰(small interfering RNA, siRNA)策略剔除细胞中内质性TSG101，随後再利用化学药物激发EBV溶裂期之进行。透过微阵列(microarray)实验法发现多种EBV晚期基因，会因TSG101的缺乏而表现受到阻滞，包括︰ BcLF1，BDLF3，BILF2，BLLF1及BLRF2等病毒基因。进一步，由reporter gene assay实验结果获悉此五个晚期基因的活化主要皆受EBV溶裂期的转活化子Rta调控。经TSG101 siRNA 减除TSG101後，Rta活化此五个晚期基因的能力便显着下降。然而，若增加细胞中TSG101的表现量， Rta启动这些晚期基因表现的能力则随之递增。其中的作用机制可能是Rta透过增加TSG101蛋白质在核中的表现量，增大了其与TSG101蛋白质在核中的结合机会。Rta藉此结合使其顺利地装载在EBV晚期基因的启动子(promoter)上，进而活化了EBV晚期基因的表现。若TSG101此时被siRNA剔除，则Rta结合到EBV晚期基因 启动子上的能力将严重受损，病毒的晚期基因产物因此而不再表现，病毒粒子的合成也告失败。
总而言之，於本研究我们首要提出TSG101的异常剪接产物TSG101-247具备了稳定 TSG101蛋白质的独特功能，并藉此增进TSG101在细胞中的机能活性。另，本研究亦揭发了TSG101在Rta活化EB 病毒晚期基因上的重要贡献。此结果显示，DNA病毒与RNA病毒一样都会夺取细胞中的TSG101来协助他们繁衍子代。唯二者利用TSG101促成病毒粒子产生的方式可能不一样。DNA病毒如EBV利用TSG101协助其表现晚期基因进而产生病毒颗粒。然而，enveloped RNA病毒则藉用TSG101运送其晚期基因产物至细胞膜表面以便组装成病毒粒子。

并列摘要〈TOP〉

The fidelity of splicing is lost in most cancers resulting in aberrant splicing of pre-mRNA. Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is a frequent target of these splicing defects, as evidenced by co-expression of its full-length transcript with truncated mRNA isoforms in a variety of human cancers. This study demonstrates that nasopharyngeal carcinomas (NPC) tissues express an abundance of TSG101 transcripts with nucleotides 154-1054 deleted (designated TSG101-247). In particular, Epstein-Barr virus (EBV)-infected NPC cells harbor this splice variant, and the incidence of expression of this variant increases during the EBV lytic cycle. The EBV-encoded viral proteins, EBNA1, Zta and Rta, are demonstrated as crucial factors that involved in the enhancement of TSG101 aberrant splicing. Mechanistically, TSG101-247 stabilizes TSG101 by impairing its polyubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Mutation of the TSG101-247 start codon showed that the variant protein, and not the RNA, blocks polyubiquitination. In addition, mutation of lysine residues in TSG101-247 that particularly disrupt the conjugation of ubiquitin (Ub) moiety negates this effect, resulting in rapid turnover of TSG101 and suggesting a requirement for Ub-chain attachment in the stabilization of TSG101 mediated by TSG101-247. To explore the underlying mechanism further, we demonstrated that TSG101-247 prevents the polyubiquitination of TSG101 by binding competitively to the TSG101-associated ligase (Tal), an E3 Ub ligase. Consequently, TSG101-247 augments the functional activities of TSG101, having a negative effect on androgen receptor-induced gene activation and a positive effect on cell proliferation. Moreover, TSG101-247 enhances TSG101-induced EB viral late gene expression. 
The requirement of TSG101 protein for EB virion formation has been established herein by an RNA interference assay. Results from an EBV DNA array reveal that depletion of TSG101 potently inhibits the transcription of five Rta-responsive EBV late genes, BcLF1, BDLF3, BILF2, BLLF1 and BLRF2. Rta is an EBV encoded immediate-early protein, which governs the reactivation of the viral lytic program by transactivating a cascade of lytic gene expression. TSG101 is involved in the mechanism underlying the expression of these EBV late genes mediated by Rta, seeing that depletion of TSG101 impairs Rta transactivation of these late promoters severely. Moreover, a concordant augmentation of Rta transactivating activity is observed when TSG101 is over-expressed following ectopic transfection. Mechanistically, Rta causes the TSG101 protein to accumulate principally in the nuclei, wherein both these proteins interact and are recruited onto the viral promoters. Of note, TSG101 is crucial for efficient binding of Rta onto these late promoters. As a result, cells with defective TSG101 fail to express late viral proteins, leading to a decrease in the yield of virus particles. 
Altogether, we provide the first functional evidence of the splicing variant of TSG101. TSG101-247 is a novel regulator of TSG101 stability thereby facilitating role of TSG101 in cellular compartment. In addition, the contribution of TSG101 to Rta-mediated late gene activation is of great importance for completion of the EBV productive lytic cycle. These observations consolidate a role of TSG101 in the replication of EBV, a DNA virus, that differs from that for RNA viruses, where TSG101 aids mainly in the endosomal sorting of enveloped late viral proteins for assembly at the plasma membrane.

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