人類免疫缺乏病毒CRF07_BC重組亞型病毒株之功能性探討

黃惠玲

doi:10.6342/NTU.2012.2012.03416

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人类免疫缺乏病毒CRF07_BC重组亚型病毒株之功能性探讨

Functional Characterization of HIV-1 CRF07_BC Strain

黄惠玲 , 硕士　　导师：张淑媛　　

繁体中文 DOI： 10.6342/NTU.2012.2012.03416

CRF07_BC亚型病毒；蛋白酶p6 ； CRF07_BC ； protease ； p6

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摘要 │ 参考文献 (77) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

影响人类免疫缺乏病毒(HIV)疾病进程快慢的主要因素可分为病毒因子和宿主的遗传因子。藉由了解疾病进程较为缓慢之感染者体内病毒的特徵，将有助於发展预防HIV感染及临床治疗的策略。在2004年之前，台湾HIV的传播主要是经由性行为接触；约70% HIV感染者经由同性间性行为感染B亚型病毒，其余则经由异性间性行为感染CRF01_AE亚型病毒。然而，在2004年，静脉药瘾族群爆发CRF07_BC亚型病毒感染。根据临床资料，我们发现，相较於B亚型病毒感染者，这些CRF07_BC感染者在接受高效能抗反转录病毒疗法(HAART)前，其体内HIV病毒量较低、CD4+血球数目较高。因此，本研究的目的为人类免疫缺乏病毒CRF07_BC重组亚型病毒株之功能性探讨。
   我们构筑出CRF07_BC 病毒株全长基因体的molecular clone (pCRF07_BC)以进行此重组亚型病毒之功能性探讨。比较B亚型与CRF07_BC重组亚型病毒株之全长基因体序列，分析CRF07_BC重组亚型之病毒基因是否带有缺失性突变，并利用功能性试验(functional assay)探讨病毒基因序列变异对病毒表现型的影响。最後，利用CRF07_BC molecular clone制造出野生型或突变型CRF07_BC病毒，以确认上述实验结果。
    经由核酸序列分析，发现相较於B亚型HXB2病毒株之LTR序列，pCRF07_BC有2个核酸删除性突变分别发生於NF-KB ⅰ及SP-1 I转录因子结合位。除此之外，相较於HXB2之LTR序列，pCRF07_BC在核酸位置340-349之间，共发生4个核酸插入性突变及2个核酸替换性突变，因而产生第三个NF-KB转录因子结合位。另外，比较pCRF07_BC与HIV资料库中B、C、CRF07_BC亚型参考株之全长基因体序列，分析CRF07_BC亚型之病毒基因是否带有缺失性突变，导致蛋白质功能缺失。发现CRF07_BC之p6基因片段发生21个核酸删除性突变，造成CRF07_BC之p6gag发生30PIDKELY36删除性突变；p6pol蛋白质发生38ADRQGTV44删除性突变。也发现CRF07_BC在Vif蛋白质Cul5 motif与BC box motif之间有天门冬醯酸(Asparagine)插入性突变；在Vpr蛋白质NLS motif有A89T突变；在Nef蛋白质N端蛋白质豆蔻醯化(myristoylation)功能区段内有G3A突变。
    之後分析临床病毒株的p6基因片段，我们发现所有的32个CRF07_BC病毒株之p6gag及 p6pol蛋白质均发生如上述之7个胺基酸删除性突变，发生删除性突变的比例为100% (32/32)。由於p6删除性突变发生的位点位於病毒蛋白酶切割位点的附近，可能影响蛋白酶切割polyprotein的效率，所以我们利用西方墨点法比较感染细胞内病毒蛋白质成份组成，来分析CRF07_BC病毒的蛋白质切割效率，发现相较於B亚型临床病毒株，CRF07_BC临床病毒株之p24gag/Pr55gag的比值较低，显示CRF07_BC亚型病毒蛋白酶切割Gag polyprotein的效率较差。为了测试这些in vitro实验结果，我们选殖CRF07_BC molecular clone制造出野生型或带有p6插入性突变之突变型CRF07_BC亚型病毒，发现将p6基因片段补回pCRF07_BC质体後，蛋白酶切割Gag polyprotein的效率上升，且病毒颗粒释放的比率增加，显示p6删除性突变是造成CRF07_BC重组亚型病毒蛋白酶切割Gag polyprotein效率较差的原因。

并列摘要〈TOP〉

HIV disease is a culmination of a complex interplay between both viral and host factors. Understanding the virologic characteristics of long-term non-progressers will help to develop strategies to prevent HIV infection and clinical treatment. Before 2004, sexual transmission is responsible for most HIV-1 infections in Taiwan. HIV-1 subtype B and CRF01_AE are the two predominant virus strains: subtype B accounts for about 70% of HIV infections and is responsible for a relative high proportion of infections among homosexual men; CRF01_AE accounts for 25% of HIV infections and is associated with heterosexual transmission. However, CRF07_BC was responsible for the outbreak of HIV-1 among intravenous drug users between 2004 and 2005 in Taiwan. According to clinicians’ observations, we found that, before highly active antiretroviral therapy, these CRF07_BC infected individuals tend to have lower viral loads and higher CD4 counts than those patients recently infected subtype B viruses. Therefore, the specific aim of this study is to determine the functional characteristics of HIV-1 CRF07_BC.
    The full-length genomes of CRF07_BC infectious molecular clone was sequenced, analyzed. Compared to LTR of HXB2, two single base deletions are amongst the NF-KB ⅰand SP-1 I binding sites, respectively. Interestingly, compared to the subtype B’s (HXB2) LTR, there is a potential third NF-KB binding site in the subtype CRF07_BC’s LTR region due to the 4 base insertions and two base substitutions at nt 340–349. In addition to, we founded HIV CRF07_BC have 7-amino-acids-deletion mutation in both p6gag and p6pol proteins, one-amino-acid insertion mutation at position 140 residue in Vif protein, A89T mutation in Vpr NLS motif and G3A mutation in Nef myristoylation functional domain. 
    Viral RNA was extracted from thirty-two patients’ plasma, and the viral nucleotide sequences of the pol region were determined using reverse transcription and nested polymerase chain reaction (PCR). Deletion of 7 amino acids in both p6gag and p6pol proteins were also noted among the Taiwanese CRF07_BC strains (32/32, 100%). The cell lysates of infected cells were used for Western blotting analysis to determine the efficiency of Gag-Pol polyprotein processing. Our results showed that CRF07_BC harbor lower Gag polyprotein processing efficiency than subtype B. CRF07_BC full-length molecular clone was constructed to confirm this finding. Site-directed mutagenesis was performed to address the effects of deletion in p6 on Gag cleavage efficiency. Our results demonstrate that 7-amino-acids-deletion in p6 can affect virus release by impairing Gag cleavage efficiency.

参考文献 ( 77 ) 〈TOP〉

1. Alexander, L., M. J. Aquino-DeJesus, M. Chan, and W. A. Andiman. 2002. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) replication by a two-amino-acid insertion in HIV-1 Vif from a nonprogressing mother and child. J Virol 76:10533-9.
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2. Alexander, L., E. Weiskopf, T. C. Greenough, N. C. Gaddis, M. R. Auerbach, M. H. Malim, S. J. O'Brien, B. D. Walker, J. L. Sullivan, and R. C. Desrosiers. 2000. Unusual polymorphisms in human immunodeficiency virus type 1 associated with nonprogressive infection. J Virol 74:4361-76.
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4. Caly, L., N. K. Saksena, S. C. Piller, and D. A. Jans. 2008. Impaired nuclear import and viral incorporation of Vpr derived from a HIV long-term non-progressor. Retrovirology 5:67.
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