柑橘黃龍病與萎縮病對台灣各主要柑橘品種之罹病率調查與診斷方法之改良

洪煦華

doi:10.6342/NTU.2014.01456

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柑橘黄龙病与萎缩病对台湾各主要柑橘品种之罹病率调查与诊断方法之改良

Survey of morbidity of citrus huanglongbing and tristeza diseases infecting several important citrus cultivars in Taiwan and improvement of their diagnostic method

洪煦华 , 硕士　　导师：洪挺轩　　

英文 DOI： 10.6342/NTU.2014.01456

柑橘黄龙病；柑橘萎缩病； Citrus Huanglongbing ； Citrus tristeza disease

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摘要 │ 参考文献 (38) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

柑橘为台湾重要经济果树，约有四万农户赖以维生。台湾栽培的柑橘大都是自大陆华南地区引进，如西元1701年引进文旦，1789年引入桶柑，1812年引入椪柑，1930年引进柳橙。早期栽培种以椪柑、桶柑及柳橙为主，至1991年，椪柑、桶柑及柳橙占栽培总面积之 85%，其他柑种所占比率仍属少量。自政府积极推动少量多样化及品种更新後，台湾栽培之柑橘品种逐年增加，至2004年已呈现品种多样化，而椪柑、桶柑及柳橙所占比率随之降为63%，麻豆文旦之总栽种面积亦高达18%。
柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)及萎缩病毒(Citrus tristeza closterovirus , CTV)普遍感染多种柑橘品种，在台湾与其他热带、亚热带柑橘产区严重危害宽皮柑及橙类，影响其产量与品质。此类病害是系统性病害，可全身性感染寄主，经无性繁殖之种苗传播，在田间亦经媒介昆虫传播或由工具机械传染而蔓延成灾。耐热型之黄龙病於1950年传入台湾，苏等称此病为立枯病，发病後缩短柑橘树龄10年以下，很快蔓延全岛，此病在东南亚及南北美洲地区亦发生流行，包括印度、美国、巴西、泰国、日本等国。
本论文针对台湾目前主要柑橘产区之萎黄植株，包括柳橙、椪柑、柠檬以及文旦之黄龙病罹病率及其与柑橘萎缩病毒之复合感染情形进行研究。将逢机采样之病叶以聚合酶连锁反应(PCR)侦测HLB，反转录聚合酶连锁反应 (RT-PCR)侦测CTV。结果显示台湾各柑橘品种平均约六成感染率，其中屏东县之柠檬感染率为38%具黄龙病，而与CTV的复合感染情形则未发现，与2007蔡等研究结果相同；产於台南县、嘉义县、新竹县、花莲县和台东县之柚类，则有46-63%感染黄龙病，而与CTV的复合感染情形则未发现；产於嘉义县与云林县之柳橙，有高达92-96%感染黄龙病，而其中有25-58%与CTV复合感染；产於台中县与嘉义县之椪柑，有37%-83%感染黄龙病，而其中有0-17%与CTV复合感染;。黄龙病与萎缩病毒之复合感染於各地区种植之柑橘品种间有极显着之差异，2014年统计之感染率与2007蔡等人之统计资料也有部分差异。
1984年苏等人曾以生物检定法调查台湾各柑橘品种均可发现感染，近年来林等发展反转录聚合酵素连锁反应(RT-PCR)检定法能更敏感且准确的侦测病原。由於各病原检测技术之进步，本研究得以分子诊断技术取代过去之生物检定法，大量检定目前台湾各重要柑橘产区之病株感染HLB之比率，亦针对柑橘萎缩病毒之复合感染情形做一调查。本研究亦针对诊断方法之改良，发展多重聚合酶连锁反应 (Multiplex PCR) 检定法，能以更敏感且更省时的方法一次侦测多种不同病原，对於大量检定各重要柑橘产区之病株提供方便又省时的改良方法。

并列摘要〈TOP〉

Citrus is one of the most important fruit crops worldwide. Citrus huanglongbing (HLB) and Citrus Tristeza Virus (CTV) are two of the most serious and destructive diseases for citrus. Because of lacking high effective bactericides and resistant citrus varieties for the diseases, many countries mainly relies on uprooting and burning diseased trees from quarantine areas; or enhancement of quarantine regulations in non-quarantine area to prevent the invasion of both diseases. 
The cultivated citrus trees infected by HLB bacteria (HLBB) were commonly discovered in the field of Taiwan. Many citrus trees were infected simultaneously with HLB bacteria and Citrus tristeza virus (CTV). In this study, we aimed at surveying of morbidity of citrus huanglongbing and tristeza diseases on several important citrus cultivars all over Taiwan and improving their diagnostic method. In the field survey, about 34% of citrus trees showing yellowing symptoms were infected by HLB , about 33% were infected by CTV and approximate 8% were co-infected with both pathogens. Sweet orange samples collected from Yunling area had a highest percentages of both HLB-infection at 71% and 79% infection for CTV. As a result, approximate 58% of the HLB bacteria-infected sweet orange were co-infected with CTV. Ponkan samples collected from Taichung had a lower percentage of HLB-infection at 4% , 33% infection for CTV and none co-infection. 38% of Eureka lemon samples collected from Pintung were infected by HLB bacteria, 46 % of pummelo samples from Tainan were infected and both of them tolerated by CTV infection. In Chiayi, the main citrus industry in Taiwan, sweet orange samples had a high percentage of CTV-infection at 88%, 33% for HLB-infection and 25% for co-infection; Ponkan samples were infected by HLB bacteria at 29%, 54% by CTV and approximate 17% for co-infection; 63% of pummelo samples were infected by HLB bacteria and none by CTV.
In this study, we aimed to improve the diagnostic method. We developed a multiplex polymerase chain reaction detection system using unique primer sets specific for Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) and also Citrus Tristeza Virus. The two fragments ( 226 for Las and 655 for CTV) were simultaneously amplified using a single PCR reaction and Reverse Transcript-PCR. Consequently, the results of the multiplex PCR were compared with simplex PCR and RT-PCR for detection of each pathogen respectively, it matched. We reported the discovery of co-infection of Las and CTV in the field citrus plants in Pingtung, Tainan, Chiayi, Yunlin, Taichung, Taiwan. Our rapid, sensitive , specific duplex assay should be useful for diagnosis of HLB and CTV especially for quarantine purpose, identification of Las and CTV, and certification and plant improvement program for obtaining HLB-free or CTV-free planting materials. This method should be applicable for confirmation of visual method upon routine symptom.

Keywords: Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), Citrus Tristeza Virus, Multiplex PCR. Detection, HLB, CTV

参考文献 ( 38 ) 〈TOP〉

Bastianel, C., M. Garnier-Semancik, and J. Renaudin, J. M. 2005. Diversity of ‘ Candidatus Liberibacter asiaticus.’ Based on the omp Gene sequence. Appl Environ Microbiol. 71(11):6473-6478.
连结：
L.G. Weather and M. Cohen (eds.), Proceedings of the 6th Conference of the International Organization of Citrus Virologists. University of California, Berkeley, pp. 12-15.
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Cambra, M. and M. T. Gorris. 2000a. Incidence and epidemiology of Citrus tristeza virus in the Valencian Community of Spain. Virus Research 71, 85-95.
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Coletta, H.D., M.L.P.N. Targon, M.A. Takita, J.D. De Negri, J. Pompeu, M.A. Machado, and G.W. Muller. 2004. First report of the causal agent of huanglongbing (“Candidatus Liberibacter asiaticus”) in Brazil. Plant Dis. 88: 1382.
连结：
Gamsey, S. M. and M. Cambra. 1991. Enzyme-linked immunosobent assay (ELISA) for citrus pathogens. In; Roistacher, C. N. ed. Graft-transmissible diseases of citrus. Handbook for detection and diagnosis. Rome, Italy: FAO, 193-216.
连结：

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