米蛋白之磷酸化與應用於米蛋白磷酸胜肽之製備

陳立於

doi:10.6342/NTU201704379

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米蛋白之磷酸化与应用於米蛋白磷酸胜肽之制备

Phosphorylation of Rice Protein and its Application on Preparation of Rice Phosphopeptides

陈立於 , 博士　　导师：许辅　　

繁体中文 DOI： 10.6342/NTU201704379

米蛋白；米蛋白水解物；磷酸化；三偏磷酸钠；双硫键；蛋白水溶性；溶钙能力； Rice protein ； Rice protein hydrolysates ； Phosphorylation ； Sodium trimetaphosphate ； Disulfide bond ； Protein solubility ； Calcium-solubilizing capacity

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摘要 │ 参考文献 (151) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

本研究尝试以磷酸化法将水难溶之米蛋白予以修饰，并探讨磷酸化对於米蛋白的低水溶性和其溶钙能力方面的改变与赋予。米蛋白之磷酸化是将米蛋白分散於pH 11.5、温度35°C之硷性溶液中，并和法规认可之食品添加物：三偏磷酸钠一并反应进行磷酯化之作用，试验结果显示20.6%之米蛋白丝胺酸可於STMP之反应下被进行磷酸化。然而，不同於过去其他蛋白质在经由磷酸化修饰後可在蛋白水溶性方面有显着之提升效果，磷酸化修饰对於米蛋白其低水溶性 (2.5%, pH 7) 之性质并未给予明显之改善。
    分析研究米蛋白分子结构内部之疏水性与双硫键两大作用力，对於磷酸化修饰提升米蛋白水溶性之效果影响，试验结果显示以尿素减缓米蛋白结构内部之疏水性作用力，对於後续磷酸化米蛋白之磷酸化程度 (22.0 %) 与水溶性 (3.6%, pH 7) 方面并无明显之提升效果。相较之下，预先将米蛋白结构内部之双硫键进行部分之还原断裂，则可显着增加後续磷酸化米蛋白之磷酸化程度 (31.3%) 与水溶性 (8.3%, pH 7) ，上述结果显示分子结构内大量之双硫键应为导致米蛋白在经过磷酸化修饰後水溶性无法提升之原因。
    另一方面，相较於对蛋白水溶性无明显之改善效果，磷酸化修饰可显着提升米蛋白於磷酸盐溶液中之溶钙能力 (由90.4 mg/g提升至147.2 mg/g) 。本研究以同样具有优异溶钙能力的酪蛋白磷酸胜肽 (casein phosphopeptide, CPP) 作为仿效对象，初步比较以先磷酸化後水解 (Type 1) 、先水解後磷酸化米蛋白 (Type 2) 两种制备途径制备含有米蛋白磷酸胜肽 (rice phosphopeptide, RPP) 之米蛋白水解物。试验结果显示Type 1磷酸化米胜肽於低水解度之情况下 (以硷性蛋白酶处理时水解度为6.7%) 可因磷酸化修饰呈现较好之溶钙能力，过度将Type 1磷酸化米胜肽进行水解，则可能使其对於钙离子之螯合结构受到破坏，降低Type 1磷酸化米胜肽之溶钙能力。对於Type 2磷酸化米胜肽之制备方面，预先以蛋白酶水解米蛋白之後有助於提升後续米蛋白样品进行磷酸化修饰时之磷酸化程度，例如以水解度3.4%之米胜肽进行磷酸化修饰时，其磷酸化程度 (50.4%) 可明显高於以未水解之米蛋白进行磷酸化时之磷酸化程度 (20.6) 。而相较於Type 1磷酸化米胜肽仅能於低水解程度之情况下相比於未磷酸化米胜肽呈现较好之溶钙能力，Type 2磷酸化米胜肽於水解程度较高之条件时，其相比於未磷酸化米胜肽仍可因较高之磷酸化程度而展现较佳之溶钙能力。然而，Type 2磷酸化米胜肽在制备上被发现有样品回收不易之缺点，将米蛋白先行水解成米胜肽在将其进行磷酸化修饰，米胜肽容易因分子量较小而於磷酸化反应後之透析脱盐步骤中与STMP等无机盐类一并流失，造成後续分析Type 2磷酸化米胜肽其磷酸化程度与溶钙能力有低估之迹象，此结果显示Type 2磷酸化米胜肽之制备方式可能不利於应用至工业上之生产，相较之下，先磷酸化後水解米蛋白之方式 (Type 1) 则可由於样品流失量小，在工业制程上有操作简易且可从中进一步精致纯化出具良好溶钙能力之米蛋白磷酸胜肽之优点。
    本研究中应证米蛋白可经由磷酸化修饰赋予更多磷酸基团，且对於磷酸化米蛋白亦表现出更好的钙离子螯合能力而言，发现其具有作为原料制得类似酪蛋白磷酸胜肽之应用潜力。基於目前产业上已有相对较成熟之米蛋白生产制程，实际从制程中导入磷酸化步骤在操作上并无太大之困难，因此利用磷酸化修饰在未来将可望制得有别於一般缺乏可利用功能特性之米蛋白配料，进一步拓展米蛋白在食品产业上之应用价值。

并列摘要〈TOP〉

The present study tried to phosphorylate rice protein (RP), a known insoluble food ingredient, and to improve its solubility and calcium-solubilizing capacity (CSC).  RP was allowed to react with an approved non-toxic food additive; sodium trimetaphosphate (STMP) in an alkaline aqueous solution (pH 11.5, 35°C).  The results indicated that 20.6% of the RP seryl residues were phosphorylated.  Interestingly, RP did not show a considerable increase in solubility (2.5%, pH 7) after phosphorylation as compared to those studies that have confirmed the protein solubility improvement via chemical phosphorylation.  The involvement of hydrophobic interactions and disulfide bonds in phosphorylated RP solubility was further evaluated.  The phosphorylation of RP in the presence of urea as a chaotropic agent for weakening the hydrophobic effect resulted in 22.0% phosphoseryl residues but still did not increase RP solubility.  The reduction of RP disulfide bonds prior to phosphorylation resulted in 31.3% phosphoseryl residues and increased RP solubility to 8.3% at pH 7, indicating that disulfide bonds within RP could be responsible for the failure to increase its solubility after phosphorylation.  
    On the other hand, it was found that the phosphorylation could enhance the CSC of RP from 90.4 mg/g to 147.2 mg/g.  To follow the example of casein phosphopeptide (CPP), a hydrolysate that features an extraordinary CSC, the present study has demonstrated two modification procedures for the preparation of rice phosphopeptides (RPP) contained phosphorylated rice protein hydrolysates (PRPH), which included chemical phosphorylation followed by the proteolysis of RP (Type 1 PRPH) or inversely the procedure of proteolysis before the phosphorylation of RP (Type 2 PRPH).  In terms of Type 1 PRPH, the results showed that the superior CSC of Type 1 PRPH could be exhibited to be below the range of the degree of hydrolysis (DH) after proteolysis (e.g., DH below 6.7% for alcalase treatment).  The phosphorylated chelating structure of Type 1 PRPH might be interrupted by excessive hydrolysis and caused a decrease in its CSC.  In the case of Type 2 PRPH, pre-hydrolysis of RP with alcalase prior to phosphorylation consequently introduced more phosphoryl residues (e.g., 50.4% at a DH of 3.4%) compared to that of Type 1 PRPH (20.6%).  Type 2 PRPH could exhibit a superior CSC at a higher DH, whereas the Type 1 PRPH only showed a better CSC than that of native RP hydrolysates at a DH below 6.7%.  However, the pre-hydrolysis of RP was found to add difficulty to sample recovery in Type 2 PRPH preparation process.  The low MW peptides of Type 2 PRPH could be easily lost during the desalting procedure after phosphorylation.  Therefore, considering the economics and ease of operation, the pre-phosphorylation-post-hydrolysis process (Type 1) might be the better procedure for preparing CSC-fortified rice protein (RP) peptides.  
    In conclusion, the present study has verified that the chemical phosphorylation could introduce more negatively charged phosphate groups and thus enhance the CSC of RP.  These findings have shown the potential use of RP for preparing the CPP-like bioactive peptides.  The CSC-fortified RP might be utilized as promising calcium-absorption enhancers and bioactive agents in future functional food ingredients.

参考文献 ( 151 ) 〈TOP〉

王英志 (2017) 。还原剂与界面活性剂於提升米蛋白功能性之应用。国立台湾大学生物资源暨农学院园艺暨景观学研究所硕士论文。台北。
连结：
Adamson, N. J. and Reynolds, E. C. 1995. Characterization of tryptic casein phosphopeptides prepared under industrially relevant conditions. Biotechnol. Bioeng. 45:196-204.
连结：
Adamson, N. J. and Reynolds, E. C. 1997. Relationship between degree of casein hydrolysis and phosphopeptide release. J. Dairy Res. 64:505-514.
连结：
Adebiyi, A. P., Adebiyi, A. O., Hasegawa, Y., Ogawa, T. and Muramoto, K. 2009. Isolation and characterization of protein fractions from deoiled rice bran. Eur. Food Res. Technol. 228:391-401.
连结：
Alder-Nissen. 1986. Enzymic Hydrolysis of Food Proteins. Elsevier Applied Science.: London.
连结：

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