以小鼠初代巨噬細胞之ex vivo和in vitro研究模式探討台灣土肉桂葉精油及其活性成分枷羅木醇及肉桂醛之抗發炎作用

洪宜葶

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以小鼠初代巨噬细胞之ex vivo和in vitro研究模式探讨台湾土肉桂叶精油及其活性成分枷罗木醇及肉桂醛之抗发炎作用

Ex vivo and in vitro studies on the anti-inflammatory effect of the leaf essential oil of Cinnamomum osmophloeum Kanehira and its active ingredients linalool and cinnamaldehyde with primary macrophage from mouse

洪宜葶 , 硕士　　导师：刘承慈　　

繁体中文

巨噬细胞； LPS ； MSU ；土肉桂叶精油；枷罗木醇；肉桂醛； TLR4 ； NLRP3 ； macrophages ； LPS ； MSU ； Cinnamomum osmophloeum Kanehira ； linalool ； cinnamaldehyde ； TLR4 ； NLRP3

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摘要 │ 参考文献 (222) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

已知灌食台湾土肉桂叶精油（TC）及其活性成分枷罗木醇（linalool；Lin）和肉桂醛（cinnamaldehyde；Cin）能够抑制小鼠因LPS（lipopolysaccharide）而诱发的系统性发炎反应，改善回肠绒毛损伤，并能抑制小鼠因尿酸而诱发慢性高尿酸血症中肾脏之发炎反应。本研究目的为利用ex vivo及in vitro模式，以小鼠初代腹腔巨噬细胞观察TC及其活性成分是否能够透过调节巨噬细胞发炎活性，而改善LPS及尿酸钠（monosodium urate；MSU）结晶所导致的组织发炎性损伤，并探讨其作用机制。Ex vivo模式之实验以十周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为六组，分别隔日灌食载剂玉米油（4 ml/kg BW）、土肉桂叶精油（13 mg/kg BW）、低剂量枷罗木醇（2.6 ml/kg BW）、高剂量枷罗木醇（5.2 mg/kg BW）、低剂量肉桂醛（0.4 ml/kg BW）和高剂量肉桂醛（0.9 mg/kg BW），共灌食八次，於最後一次灌食後隔日腹腔注射Brewer thioglycollate medium（4%，2 ml），四天後牺牲，收集腹腔巨噬细胞，而in vitro模式则於十周龄正常雄性C57BL/6小鼠如上述腹腔注射之方法收集腹腔巨噬细胞。Ex vivo模式於培养液中加入LPS，而in vitro模式先在培养液中加入TC（5、25、75 μg/ml）、Lin（2.0、10.1、30.2 μg/ml）及 Cin（0.3、1.7、5.2 μg/ml）预处理半小时，再於LPS或MSU刺激下同时添加上述各剂量TC、Lin和Cin，培养24小时。然後收集培养液分析其中nitrate/nitrite、促发炎细胞激素IL-1β及TNF-α、抗发炎细胞激素IL-10浓度，并且收集巨噬细胞以Western blotting分析细胞中TLR4和NLRP3讯号路径相关分子之表现量。结果显示，不论是在ex vivo模式中以灌食的方式或是in vitro模式中添加於培养液中给予TC、Lin及Cin，均可抑制LPS诱发巨噬细胞产生nitrate/nitrite及IL-1β，并且在ex vivo模式中还可抑制细胞产生TNF-α。TC抗LPS诱发之发炎作用在ex vivo模式中，主要可归因於其抑制细胞TLR4蛋白质表现量，而在in vitro模式中则归因於其抑制细胞MD2和NLRP3蛋白质表现量。TC主要活性成分Lin和Cin在ex vivo模式中，对於TLR4和NLRP3路径讯号分子表现量的调控虽与TC并不一致，但在in vitro模式中则具有一致性，推论在小鼠灌食TC及其活性成分会因对於巨噬细胞以外的生理系统具有差异性的影响，而间接造成巨噬细胞ex vivo活性之差异性。此外，在以MSU刺激巨噬细胞的in vitro模式中，发现於培养基中添加TC、Lin及Cin，均可降低培养液中的IL-1β及TNF-α之浓度，且可归因於TC及这些活性成分能够抑制细胞NLRP3蛋白质表现量。由本研究结果得知，TC及其活性成分Lin及Cin不论是在LPS或MSU诱发之巨噬细胞发炎反应，均具有改善的效果，显示对於感染性的革兰氏阴性菌或非感染性的痛风性发炎病症的预防或治疗上，均具有应用潜力。

并列摘要〈TOP〉

We previously reported the protective effect of the leaf essential oil of Cinnamomum osmophloeum Kanehira (TC) and its active ingredients linalool (Lin) and cinnamaldehyde (Cin) on LPS-induced systemic inflammatory response syndrome and the intestinal damage and on inflammatory condition in chronic hyperuricemia in mice. The aim of the present study is to investigate the anti-inflammatory effect of Lin, Cin, and TC on LPS- or monosodium urate (MSU)-stimulated macrophages and the underlying mechanisms ex vivo and in vitro. In the ex vivo study, male C57BL/6 mice were randomly divided into six groups, and gavaged every other day with corn oil (4 ml/kg BW), TC (13 mg/kg BW), Lin (2.6 mg/kg BW) or Cin (0.9 mg/kg BW) for eight times. At the day after the last treatment, all mice were injected peritoneally with 4% Brewer thioglycollate medium (2ml/ mouse) followed by the collection of peritoneal macrophages four days after the injection. The cells were cultured for 24h with LPS followed by the determination of the concentrations of nitrate/nitrite, IL-1β, TNF-α and IL-10 in culture medium and cellular expression of TLR4, MD2, MyD88, NLRP3, ASC, and caspase-1. The same analysis was carried out in the in vitro study but with peritoneal macrophages collected from normal male C57BL/6 mice and were preincubated with TC (5, 25, 75 μg/ml), Lin (2.0, 10.1, 30.2 μg/ml) or Cin (0.3, 1.7, 5.2 μg/ml) for half an hour, before the treatment with LPS or MSU for 24 h. The present study found that TC, Lin and Cin inhibited the secretion of nitrate/nitrite and IL-1β ex vivo and in vitro, and inhibited the generation of TNF-α ex vivo by LPS-induced macrophages. Such anti-inflammatory activity of TC can be attributed to its inhibitory effect on TLR4 expression ex vivo, and its inhibitory effect on MD2 and NLRP3 expression in vitro. In addition, TC, Lin and Cin were found to lower the secretion of IL-1β and TNF-α by MSU-induced macrophages. This can be attributed to the inhibitory effect of TC, Lin and Cin on the expression of NLRP3 protein. In summary, the present study demonstrated that TC and its active compositions Lin and Cin, can reverse inflammatory response of macrophages induced by LPS and MSU and suggesting the prophylactic and therapeutic use of them on Gram-negative bacteria-induced and gouty inflammation.

参考文献 ( 222 ) 〈TOP〉

Abderrazak, A., Syrovets, T., Couchie, D., El Hadri, K., Friguet, B., Simmet, T. and Rouis, M. (2015) NLRP3 inflammasome: from a danger signal sensor to a regulatory node of oxidative stress and inflammatory diseases. Redox biology, 4, pp. 296-307.
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