構築含人類腎上腺腦白質退化症蛋白ALDP基因的酵母菌表現質體並於酵母菌中分析其蛋白特性

陳雅雯

山西大学，您好！

感谢采购，人社期刊库｜人社论文库，期间：2025/01/01~2025/12/31

感谢试用，科学期刊库｜科学论文库，期间：2024/10/20~2025/01/20

浏览高级检索

关闭
检索检索高级检索出版物检索
浏览期刊主题浏览核心期刊浏览期刊拼音浏览

关闭

查询符号(半角)	查询符号意义说明
空格	表示为「AND」两个查询词之交集
双引号 ( " " )	片语以双引号标示开始及结束，而且只寻找出现顺序相同的字词，例： " image process "
?	表示一个字母切截，输入两个?表两个字母，依此类推，例：输入「Appl?」，查得结果应为appl e , appl y … ( 常用于英文字查询 )
*	表示不限字母切截，由0~n. 例：输入「appl*」，查得结果应为appl e , appl es , appl y , appl ied , appl ication … ( 常用于英文字查询 )
AND、OR、NOT	布尔逻辑组合关键字，用来扩大或缩小查询范围的技巧。 (1) AND ：缩小查询范围 (2) OR ：扩大查询范围(3) NOT：排除不相关的范围

DOI 是数位物件识别码（ D igital O bject I dentifier ）的简称，
为物件在网路上的唯一识别码，可用于永久连结并引用目标物件。

使用DOI作为永久连结

每个DOI号前面加上「 http://dx.doi.org/ 」便成为永久网址。
如以DOI号为 10.5297/ser.1201.002 的文献为例，此文献的永久连结便是： http://dx.doi.org/ 10.5297/ser.1201.002 。
日后不论出版单位如何更动此文献位置，永久连结所指向的位置皆会即时更新，不再错失重要的研究。

引用含有DOI的文献

有DOI的文献在引用时皆应同时引用DOI。若使用APA、Chicago以外未规范DOI的引用格式，可引用DOI永久连结。

DOI可强化引用精确性、增强学术圈连结，并给予使用者跨平台的良好使用经验，目前在全世界已有超过五千万个对象申请DOI。如想对DOI的使用与概念有进一步了解，请参考（）。

书目管理工具

相关连结

问题回报

全文下载

构筑含人类肾上腺脑白质退化症蛋白ALDP基因的酵母菌表现质体并於酵母菌中分析其蛋白特性

Construction of a yeast expression plasmid containing the gene of human adrenoleucodystrophy protein (ALDP) and property analysis of ALDP protein in Saccharomyces cerevisiae

陈雅雯 , 硕士　　导师：蔡荣宗　　

繁体中文

人类肾上腺脑白质退化症；过氧化体；极长链脂肪酸；同源二聚体；异源二聚体。； Adrenoleukodystrophy；peroxisome；very long-chain fatty acids；homodimer；heterodimer.

0 个人觉得这篇文章赞

摘要 │ 参考文献 (34) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

摘要:
 人类肾上腺脑白质退化症(Adrenoleukodystrophy, ALD)是一种罕见性联隐性遗传疾病，85%由母亲遗传X染色体，发病率约1/20000~1/50000。与此病有关的基因是位於X染色体长臂Xq28位置的ATP-binding cassette, sub-family D, member 1基因(ABCD1)，若基因有突变会使得患者细胞中的过氧化体(peroxisome)因运输脂肪酸功能异常，无法顺利地代谢C24~C26以上之极长链脂肪酸(very long-chain fatty acids,VLCFA)，病患的大脑白质与肾上腺皮质会沉积大量极长链脂肪酸，而侵害脑神经系统的髓鞘质(myelin)，造成神经传导出现障碍，ALD病患经诊断後通常数年内会死亡。人类ABCD1基因所表达的ALDP蛋白归属於ABC运输蛋白家族，当基因正常时，过氧化体膜上的两个半ABC运输蛋白ALDP透过ATP水解形成同源二聚体(homodimer)，协助运输极长链饱和脂肪酸。真核生物酵母菌也含有相似於人类的过氧化体半ABC运输蛋白，称为Pxa1p与Pxa2p，它们会形成异源二聚体(heterodimer)，在经由ATP水解辅助运输脂肪酸进入过氧化体内进行β氧化作用方面而言是人类ALDP的同功同源蛋白，因此我们选用酵母菌作为ALDP的研究工具。我的研究是以primer-243、244扩增pCS6(BC015541)上的ALDP cDNA片段当作insert，以赵俊钦学长构筑的pCC9切除PXA1-HA之後当作载体构筑成pCY1，再以这个质体做为模板以primer-HS1、250扩增接上HA tag构筑出pCY2，接着将pCY2送入酵母菌BJ2168中表现蛋白，采用洪伟智学长建立的快速制备酵母菌裂解物方法进行蛋白质表现分析，另外取黄杰懋学长构筑的pET-15B-DH4ΔE-PXA1-CHA送入大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导蛋白表现作为HA抗体在西方墨点法中的控制组。由西方墨点分析结果发现，与控制组BJ2168 (pRS416-Gal)相比，BJ2168 (pCY2)在预期的分子量位置并无出现任何蛋白质讯号，因此pCY2质体在酵母菌中无法表现出蛋白。将来可能需要更换成其他酵母菌的promoter (例如GAL promoter)，测试是否可以成功表达人类ALDP蛋白。能够成功表达ALDP蛋白才能解释突变的效应并提供ALD疾病病理的生化基础。

并列摘要〈TOP〉

Abstract
 Human adrenal white matter degeneration (Adrenoleukodystrophy, ALD) is a rare recessive genetic disorder. 85% of ALD patients inherit the defective gene from mother’s X chromosome and so this disease is called X-ALD. The incidence rate of X-ALD is about 1/20000 ~ 1/50000. X-ALD is genetically linked to ABCD1 gene (the ATP-binding cassette, the sub-family D). The mutation of this gene resulted in disability to transporting the very-long-chain (C24~C26 or above) saturated fatty acid (VLCFA) into peroxisome for β-oxidation. The patient's white matter and adrenal cortex will deposit a large number of VLCFA. The VLCFA accumulation will be harmful to the myelin of the brain system, resulting in nerve degenerated disorders. The ALD patients will die usually within a few years after diagnosis. ALDP protein belongs to the half-ABC transporter protein family. When the ALDP gene is normal, the two ALDP on the peroxidation membrane form a homodimer through the help of ATP hydrolysis and function in transporting VLCFA. Eukaryotic yeasts also contain human-like peroxisome half-ABC transport proteins, called Pxa1p and Pxa2p, which form heterodimers. They are the orthologous protein of human ALDP in aspects of β-oxidation and transport of long-chain fatty acids into peroxisome. Therefore, we use yeast as a research tool for ALDP. In previous studies of others, it has been known that ALDP gene can be expressed in yeast. So, I want to clone ALDP cDNA into yeast expression vector to express ALDP protein. I use a ALDP cDNA containing plasmid pCS6 (BC015541) as a PCR template and primer 243/244 to perform PCR cloning and replace PXA1 gene within pCC9 constructed by Jiun-Chin Jau, making the plasmid pCY1. In pCY1, ALDP expression was driving by the promoter of PXA1. Then, I used pCY1 as a template and primer HS1/250 to perform PCR cloning for introducing HA tag to c-terminus of ALDP, making pCY2. I transformed the plasmid pCY2 into the yeast BJ2168 to express protein. Besides, I did the transformation of pET-15B-DH4ΔE-PXA1-CHA, which was constructed by Huang Jie-Mao, into BL21 (DE3) and induced PXA1C-HA protein expression by IPTG. This overexpressed PXA1C-HA protein was used as HA antibody control in the western blot assay. I prepared the yeast lysate by the quite convenient method developed by Wei-Zhi Hong. The western blot analysis of total lysate from BJ2168 (pCY2) showed no significant protein expression as compared with BJ2168 (pRS416-Gal). This result indicated ALDP protein could not be overproduce under regulation of PXA1 promoter from pCY2. In the future, we will replace PXA1 promoter with more powerful yeast GAL promoter for successfully producing ALDP protein. The successful overproduction of ALDP in yeast will provide us a biochemical basis for pathology of ALD disease.

参考文献 ( 34 ) 〈TOP〉

1. R. J. A.Wanders, “Metabolic functions of peroxisomes in healthand disease,” Biochimie, vol. 98, no. 1, pp. 36–44, 2014.
连结：
2. R. J. A. Wanders and H. R. Waterham, “Biochemistry of mammalian peroxisomes revisited,” Annual Review of Biochemistry,vol. 75, pp. 295–332, 2006.
连结：
3. S. Ferdinandusse, S. Denis, P. A.W.Mooyer et al., “Clinical and biochemical spectrum of D-bifunctional protein deficiency,”Annals of Neurology, vol. 59, no. 1, pp. 92–104, 2006.
连结：
4. S. Ferdinandusse, S. Denis, C. W. T. Van Roermund, R. J. A.Wanders, and G.Dacremont, “Identification of the peroxisomal 훽-oxidation enzymes involved in the degradation of long-chain dicarboxylic acids,” The Journal of Lipid Research, vol. 45, no. 6,pp. 1104–1111, 2004.
连结：
5. R. J. Wanders, H. R. Waterham, and S. Ferdinandusse,“Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum,” Frontiers in Cell and Developmental Biology, vol. 3,article 83, 2016.
连结：

国际计量

〈TOP〉

E-mail ：

文章公开取用时，将寄通知信至您填写的信箱地址

E-mail ：

使用DOI作为永久连结

引用含有DOI的文献

DOI可强化引用精确性、增强学术圈连结，并给予使用者跨平台的良好使用经验，目前在全世界已有超过五千万个对象申请DOI。 如想对DOI的使用与概念有进一步了解，请参考 （ ） 。

DOI可强化引用精确性、增强学术圈连结，并给予使用者跨平台的良好使用经验，目前在全世界已有超过五千万个对象申请DOI。如想对DOI的使用与概念有进一步了解，请参考（）。