α相位固醇/類固醇醣苷之合成研究

郭庭瑋

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α相位固醇/类固醇醣苷之合成研究

Study on the Biosynthesis of Sterol/Steroid α-Glycosides

郭庭玮 , 硕士　　导师：吴东昆　　

英文

皂苷；糖基转移酶； saponin ； glycosyltransferase

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摘要 │ 参考文献 (23) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

皂苷为一种广泛分布於植物、真菌以及低等海洋生物中的的次级代谢物质，依碳骨架结构的不同可分为四环三萜类以及五环三萜类，整体结构主要可分成两部分:(1)亲脂性的苷元 (2)亲水性的糖基。而皂苷会因苷元连接醣数的差异，分为单醣链皂苷、双醣链皂苷甚至三醣链皂苷；皂苷於药用工业上有着极大的潜力，其可被安全的用於抗癌、抗微生物以及作为生物抑制剂等等，用途可说是相当的广泛。皂苷的生物合成路径整体分为三大步骤:(1) 最初的皂苷原碳骨架由氧化鲨烯环化酵素进行之环氧化形成 (2) 碳骨架上特定位置之碳原子与氢氧化酶产生氢氧化作用 (3) 醣基转移酶於羟基上键结上醣基
形成醣苷键；转醣作用中主要会键结起疏水性的苷元以及亲水性的醣基，此外，皂苷上的醣基对於皂苷本身的生物活性有重要影响。许多研究指出醣化作用对於皂苷的生物活性扮演着相当重要的角色，此外也会对该化合物增进许多的溶解性以及稳定性。而我的研究中，因考虑到许多醣基不易取得或是价格昂贵，故第一步先针对不同的醣基来进行生物合成；接着进一步测试能否与转醣酶和实验室现有的四环固醇类成功催化出皂苷，如此一来，不仅可以解决材料上的问题，而且将会有许多种的皂苷可以继续往後发展及研究。
在此论文中，主要对於比菲德氏婴儿双歧杆菌 (Bifidobacterium infantis)中的氮-乙醯六碳糖激酶 (N-acetylhexosamine 1-kinase, NahK)、大肠杆菌(Escherichia coli)中的半乳糖激酶(Galactokinase, Galk)、比菲德氏龙根菌(Bifidobacterium longum)中的尿苷二磷酸醣焦磷酸化酶(UDP-sugar pyrophosphorylase, USP)、多杀型巴斯德杆菌(Pasteurella Multocida)中的无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase, PpA)以及幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)中的HP0421以上五条基因作为研究，其中一条的转醣酵素基因： 幽门螺杆菌 (Helicobacter  pylori) 中的 HP0421 因其特别的α-
转醣机制，故为主要研究对象。而参考於先前学姊的研究结果，目前主要针对五种四环固醇类作为转醣酵素的修饰对象。首先利用分子转殖技术将其基因接合到表现载体上，并利用大肠杆菌 (E.coli) 系统进行蛋白质诱导後，对酵素进行活性分析。初步由薄层层析法确认活性，观测是否有新分子的产生，接着以高效液相层析法做二次确认，此外两者分析法皆可近一步做产物的分离。未来将藉由可被催化反应之受质来分析是否可进行更多不同的转醣，亦或是可经由转醣酵素形成更多不同组合的多糖链皂苷的结构，并以分子模拟的方式，更深入了解酵素催化机制，以期应用於未来之生物活性分析。

并列摘要〈TOP〉

Saponins are widespread in our surroundings. They are a group of secondary metabolites expressed in plants, fungi and lower marine animals. Saponins can be divided into tetracyclic triterpenoids and pentacyclic triterpenoids based on their carbon skeletons. The whole structure is classified into two parts: hydrophobic sapogenin and hydrophilic sugar moiety. Saponins are divided into monosaccharide saponins, disaccharides saponins and trisaccharides saponins and have great potential for the pharmaceutical industry, they can be used as anti-cancer and anti-microbe agent as well as biochemical inhibitors. The biosynthesis of saponins are mainly achieved through the following three steps: (1) initial sapogenin backbones are formed by epoxidation of oxidosqualene cyclase; (2) hydroxylation of specific sapogenin carbon; and (3) glycosyltransferase catalyzes saccharides to form glycosidic bonds with sapogenins; glycosylation will bond hydrophobic sapogenin and hydrophilic sugar moieties. Moreover, glycosylation is particularly important for biological activity in several saponins. Furthermore, glycosylation can also improve solubility and stability. In my research, not only does this have an impact on biosynthesis of nucleotide diphosphate sugars, but it also catalyzes different sterols/steroids glycosides. Using this mechanism, development and research of glycosides would be much easier and diversified in the future.
In this thesis, the following five genes were successfully cloned and expressed in an E. coli system: NahK (Bifidobacterium infantis), GalK (Escherichia coli), BLUSP (Bifidobacterium longum), PmPpA (Pasteurella Multocida) and HP0421 (Helicobacter pylori). All of these proteins were successfully purified using Ni-NTA chromatography. The glycosyltransferase HP0421 is of most interest due to its unique α-glycosylaion. According to previous studies, we focused on the activities of α-glycosyltransferase on five compounds: trans-androsterone, cis-androsterone, dehydroepiandrosterone, pregnenolone and cholesterol. They were determined and characterized using thin layer chromatography and high performance liquid chromatography.

参考文献 ( 23 ) 〈TOP〉

1. Victoria Guixe, Felipe Merino / 2009 / The ADP-dependent Sugar Kinase Family:Kinetic and Evolutionary Aspects / IUBMB Life / 61(7): 753–761.
连结：
2. Steven K. hanrs, Tony hunter / 1995 / The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification / The FASEB Journal / 9(8): 576-596.
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3. Leszek A. Kleczkowski, Daniel Decker, Malgorzata Wilczynska / 2011 / UDP-Sugar Pyrophosphorylase: A New Old Mechanism for Sugar Activation / Plant Physiology / 156(1): 3-10.
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5. L.L. Lairson, B. Henrissat, G.J. Davies, and S.G. Withers / 2008 / Glycosyltransferases: Structures, Functions and Mechanisms / Annual Review of Biochemistry / 77: 521-555.
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6. Christelle Breton, Lenka Š najdrová, Charlotte Jeanneau, Jaroslav Koca, Anne Imberty / 2006 / Structures and mechanisms of glycosyltransferases / Glycobiology / 16(2): 9–37.
连结：

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