即時聚合酶連鎖反應（Real-time PCR）在植物病毒病害檢測上之應用

10.29563/ZHWHGX.201205.0025

趙佳鴻

臺中區農業改良場特刊

111號（2012 / 05 / 01）

131 - 135

繁體中文

PCR是polymerase chain reaction的簡稱，中文為「聚合酶鏈鎖反應」。這方法能使少量DNA（deoxyribonucleic acid，去氧核醣核酸）無限量地複製。自從此技術被加理．莫理斯（Kary B. Mullis）發明開發至今，在生物科技上的用途相當廣泛，如應用在醫學、遺傳學、藥物設計上等，還有許多病毒和細菌的傳染都是靠PCR方法診斷出來的。幾乎是生物學門中最被普遍使用的技術。PCR主要是運用DNA的變性、黏合及延伸等三步驟的循環，連續增幅目標DNA片段。在人類的疾病或其他動植物的疫病蟲害檢測上，以PCR為基礎的技術都被廣泛的應用，諸如多重聚合酶連鎖反應（Multiplex PCR）、巢式聚合酶連鎖反應（Nested PCR）、逢機增幅多態型－聚合酶連鎖反應（RAPD-PCR）、序列特徵化增幅區域（SCARs）、聚合酶連鎖反應－限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）以及即時聚合酶連鎖反應（Real-time PCR）等。其中Real-time PCR近年被應用的機率逐漸提高，除了反應時間大量的縮短之外，儀器及技術亦不斷的創新進步，真正可以做到兼顧到準確度、敏感度及高效率的多項優點。Real-time PCR跟傳統PCR不同之處在於前者可經由光學系統去監測反應中產物量（藉由螢光物質的標定）的變化而反應在電腦上，後者則必須等反應結束後再進行洋菜膠體電泳分析。Real-time PCR的配備主要有PCR機器、光學系統及電腦。隨著技術的改良進步，Real-time PCR在精確度及敏感度都優於傳統PCR。目前Real-time PCR螢光系統可大致分為「非探針型」及「探針型」。（一）「非探針型」的系統就是在反應中加入會與雙股DNA嵌合而釋放出螢光的物質，目前最常被使用的螢光染劑是SYBR-green I，這種物質會嵌入在雙股DNA的小凹槽（minor groove）而釋放出可被偵測的螢光，所以當PCR產物越多時，嵌入的SYBR-green I就越多，釋放出的螢光也就越多。（二）「探針型」系統相對上就較為複雜，反應中除了要有專一性的引子對之外，另外還要在引子對之間DNA序列中找到具有專一性的片段來作為探針，如果不是目標物種來做偵測，探針就不會雜合到核酸上，之後也就不會釋放出螢光而被偵測到，所以「探針型」系統的專一性也就相對比較高。Real-time PCR的優點就實驗時間可以大幅縮短，也可在電腦上即時監測實驗結果，且鑑定的專一性、敏感度及準確度也較一般PCR方式為高。檢測過程不用進行洋菜膠體電泳分析，除了可以節省時間及洋菜膠的材料費外，也可避免多做這個實驗所造成的污染及操作誤差。目前應用Real-time PCR在偵測及研究植物病蟲害的例子很多，應用於植物病毒病害諸如木瓜輪點病毒（Papaya ringspot virus, PRSV）、木瓜畸葉嵌紋病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）、番茄斑點萎凋病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、柑橘病毒病害（Citrus viruses）、Cucurbit yellow stunting disorder virus （CYSDV）及番茄黃化捲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）等。以柑桔類重要病毒病害－Citrus psorosis virus （CPsV），Citrus variegation virus （CVV）及Citrus tristeza virus （CTV）的例子來看，目前都對於柑桔產業的危害相當嚴重，如何快速而精準的鑑定此病原菌在植物檢疫或防疫上都非常重要。義大利的研究人員於2010年發表一篇以Realtime PCR快速鑑定柑橘病毒病害的論文，他們以TaqMan的方法，開發了多組的引子對及探針，比傳統RT-PCR（Reverse transcript-polymerase chain reaction）技術快速而更靈敏100－1000倍的鑑定柑橘病毒病害，此技術可提供全球其他國家進行植物檢疫或防疫的病原鑑定參考。