大鼠初代星狀膠質細胞與人類星狀膠質細胞株之丙烯醯胺毒性分析

王嬿琇

doi:10.6342/NTU.2012.02026

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大鼠初代星状胶质细胞与人类星状胶质细胞株之丙烯醯胺毒性分析

The Analysis of Acrylamide-induced Toxicity on Rat Primary Astrocyte and Human Glioblastoma Cells

王嬿琇 , 硕士　　导师：周晋澄　　

繁体中文 DOI： 10.6342/NTU.2012.02026

丙烯醯胺；神经毒性；细胞凋亡；初代星状胶质细胞； Acrylamide ； Neurotoxicity ； Apoptosis ； Primary astrocyte

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摘要 │ 参考文献 (232) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

丙烯醯胺 (Acrylamide；ACR) 为一具有神经毒性、基因毒性、繁殖毒性与致癌性的工业用化合物，广泛运用於过滤饮水与蛋白质分析。由於胺基酸会与碳水化合物在高温 (120－180oC) 下藉由梅纳反应 (Maillard reaction) 生成副产物ACR，特别是富含天门冬胺酸与还原糖的日常食品中所产生的ACR更是一般饮水限制量的数百倍，此发现引发食品安全的疑虑。
	在人类流行病学上以及实验动物的证据皆能证实ACR能影响神经元并造成神经毒性，但对於胶细胞的研究却十分局限。星状胶质细胞成为近年来神经毒性研究的焦点，其在大脑的角色不再是被动、简单的物理性支持，而是能影响神经生长、神经电位传导以及控制整个大脑微环境 (micro-environment) 等等的重要细胞。Chen等 [2009, 2010]研究发现，ACR使人类胶胚母细胞株U-1240 MG的增生率受抑制、细胞存活率降低，造成基因毒性，进而影响DNA 伤害反应路径相关蛋白如ATM/ATR、p53、p21、p27、Cdk2及cyclinD1，并使细胞周期停滞在G0/G1期，但ACR对不同细胞株 (U-1240 MG、U-87 MG与U-251 MG) 引发的效果不同，本研究因此探讨上述细胞株与大鼠初代星状胶质细胞经ACR暴露後之细胞毒理与凋亡反应之异同。
	MTT assay结果显示，四株细胞经1 mM ACR处理48及72小时与2 mM ACR处理 24至72小时，细胞存活率均显着下降，但0.1 及0.5 mM低浓度仅对U-87 MG及初代星状胶质细胞具有显着影响。LDH leakage assay显示，U-1240 MG与U-251 MG至72小时皆无显着变化，但U-87 MG及初代星状胶质细胞在2 mM ACR暴露48及72小时下显着上升。流式细胞仪分析显示，ACR引发所有细胞株与初代星状胶质细胞之sub-G1期增加，且JC-1染色粒线体膜电位亦有明显变化，意即具细胞凋亡反应。进一步利用西方墨点法侦测DNA伤害反应路径 (如p53与pp53) 及细胞凋亡途径相关蛋白分子 (如Bcl-2、Bax、pro-caspase 8、9与3)，U-1240 MG及U-251 MG细胞经2 mM ACR暴露48小时後，Bcl-2蛋白表现量显着增加，而在U-87 MG及初代星状胶质细胞中则显着减少；初代星状胶质细胞暴露不同ACR浓度，Bcl-2表现量也不同，其在低浓度组 (0.1及0.5 mM) 显着增加，在高浓度组 (1及2 mM) 则显着减少。Bax与pro-caspase 8、9及3蛋白表现量在不同细胞以及不同浓度皆无显着差异，Bax蛋白为上升而pro-caspase 8、9及3蛋白皆为下降。而在DNA伤害反应路径中，2 mM ACR 48小时的暴露也造成p53及pp53蛋白的增加，利用caffeine抑制剂共同处理抑制掉ATM/ATR後也可得到效果回复的结果。由於ACR引发U-87 MG之MTT、LDH、sub-G1 arrest、p53、pp53与Bcl-2蛋白表现等与初代星状胶质细胞较相似，因此在考量动物牺牲与初代细胞的培养时间及相关技术要求前提下，建议以此细胞株取代星状胶质细胞从事ACR之毒性机制研究。

并列摘要〈TOP〉

Arylamide (ACR) is common used in industry for clarifying drinking water and protein analysis. ACR contains neurotoxicity, genotoxicity, reproductive toxicity and carcinogenicity. Under high-temperature (120－180oC) cooking, food rich with amino acid, particular asparagine, and reduced glucose can produce ACR through Maillard reaction more than 100 times the limits in drinking water which raises food safety concern. 
	There are several evdences showed ACR influenced neurons and induced neurotoxicity in human epidemiological studies and animal experiments. However, However, there are limited studies on ACR-induced toxicity of glia cell. Until recently, The role of astrocytes in the brain is no longer simple and passive but plays an active function including influencing neurite growth and transmission of nerve impulses, and controlling microenvironment. Chen et al. [2009, 2010]reported two studies about ACR-induced cytotoxicity on U-1240 MG cell. Further studies showed ACR caused genotoxicity, arrested cell cycle in G0/G1 phase and influenced protein associated with DNA-damage response pathway including ATM/ATR, p53, p21, p27, Cdk2 and cylinD1. Nevertheless, different cell lines (U-1240 MG, U-87 MG and U-251 MG) had different reactions after ACR exposure, for example, U-251 MG cells had no regulation of p53 and p21 protein under ACR treatment but U-1240 MG and U-87 MG cells did. The aim of this study determines which cell line has mostly similar toxic effect with rat primary astrocyte in apoptosis pathway in order to further study the ACR-induced astrocytoxic machnism.
 	The results in MTT assay showed decreasing cell viability was found after ACR 1 mM under 48 and 72 h and 2 mM under 24 to 72 h exposure among four cells in time-dependent and dose-dependent manners. Interestingly, there were changes in low concentration (0.1 and 0.5 mM) only on U-87 MG and primary astrocyte. Also, ACR didn’t induced LDH leakage on U-1240 MG and U-251 MG but on U-87 MG and primary astrocyte after 48 and 72 h 2 mM ACR exposure in LDH assay. ACR raised the sub-G1 phase analyzed by PI stain and change of mitochrondral potential analyzed by JC-1 stain among four cells. Moreover, the apoptotic mechanism was under explored by measuring the DNA damage response pathway proteins including p53 and pp53 and apoptosis pathway associated-molecular proteins including Bcl-2, Bax, pro-caspase 8, 9 and 3 through western blotting analysis. 2 mM ACR increased p53 and pp53 activity in DNA damage response pathway. The co-treatment of ACR with ATM/ATR inhibitor caffeine can attenuate the increase amount of p53 and pp53. Bcl-2 changed with different cells: up-regulation was found on U-1240 MG and U-251 MG and down-regulation was found on U-87 MG and primary astrocyte after 48 h 2 mM ACR exposure. Besides, different concentration ACR also caused different response: up-regulation of Bcl-2 was found in 0.1 and 0.5 mM concentration and down-regulation was found in 1 and 2 mM concentration on primary astrocyte. The up-regulation of Bax and down-regulation of pro-caspase 3, 8 and 9 were found at 0.1, 0.5, 1 and 2 mM ACR 48 h treatment. In conclusion, U-87 MG had the more similar response with primary astrocyte after ACR exposure. We advise the researchers subsequently studied the machanism of ACR-induced astrocytotocixity that U-87 MG cell line should be the best choice for saving the time and technique of the culture of primary astrocyte.

参考文献 ( 232 ) 〈TOP〉

王姵文。加热温度与时间对於籼米谷粉形成丙烯醯胺之影响。国立台湾大学食品科学研究所。2005。
连结：
陈炯翰。丙烯醯胺诱导U-1240 MG星状胶细胞株伤害及其调控。国立台湾大学兽医专业学院兽医学研究所。2011。
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连结：
郑维智。台湾地区点心食品丙烯醯胺含量及其风险评估暨拟似食品模拟系统中丙烯醯胺之形成与消失。国立台湾大学食品科技研究所博士论文。2009。
连结：
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连结：

国际计量

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