絲氨酸229磷酸化的動態循環對於C型肝炎病毒非結構性蛋白質5A的連續磷酸化以及病毒複製極為重要

蔡佳倪

doi:10.6342/NTU201803753

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丝氨酸229磷酸化的动态循环对於C型肝炎病毒非结构性蛋白质5A的连续磷酸化以及病毒复制极为重要

Dynamic cycles of serine 229 phosphorylation are critical to sequential phosphorylation of the HCV non-structural protein 5A and viral replication

蔡佳倪 , 硕士　　导师：余明俊　　

英文 DOI： 10.6342/NTU201803753

C型肝炎病毒；磷酸化；非结构性蛋白质5A ；连续磷酸化；病毒复制； hepatitis C virus ； phosphorylation ； non-structural protein 5 A ； sequential phosphorylation ； viral replication

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摘要 │ 参考文献 (58) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

C型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）的非结构性蛋白5A（non-structural protein 5A，NS5A）对於HCV病毒的生命周期非常重要。NS5A能被加上磷酸根进而形成两种磷酸化态，分别为低度磷酸化态以及高度磷酸化态，以免疫墨点法观查到此两种状态分别位於56 kDa以及58 kDa的位置。许多文献指出，透过连续磷酸化位於第一低复杂度序列 (low complexity sequence I) 区域中的丝氨酸群，可以让NS5A被高度磷酸化，并参与在病毒的复制与病毒颗粒的组装，但「连续磷酸化」的机制尚未明了。在先前的研究中，利用三个对NS5A中第232、235、以及238丝氨酸位点具有专一性的抗体，讨论出丝氨酸232的磷酸化会透过第一型酪蛋白激酶（casein kinase I，CKI）进行连续磷酸化（sequential phosphorylation）调控丝氨酸235及238的磷酸化，并因此而造成高度磷酸化的出现。值得注意的是，CKI偏好特定的序列来进行磷酸化（pS/T-X-X-S/T），而位於丝氨酸232前面的丝氨酸229刚好符合此序列，由生物体外激脢实验（in vitro kinase assay）得知丝氨酸229磷酸化会藉由CKI引发丝氨酸232的磷酸化。在本研究中，我们试图去测试丝氨酸229究竟有无被磷酸化，那它是否为开启连续磷酸化的第一个胺基酸呢？将丝氨酸229突变为丙氨酸（S229A）使229不能被磷酸化後会降低NS5A的连续磷酸化；然而用天冬氨酸模拟磷酸化（S229D）则能回复从丝氨酸232开始到丝氨酸238的连续磷酸化，意味着丝氨酸229磷酸化能够开启如此的连续性的磷酸化。利用对丝氨酸229具专一性的抗体发现丝氨酸229的磷酸化程度相当低，并在56及58 kDa都被侦测到，意外的是，在丝氨酸235天冬氨酸突变的NS5A中，丝氨酸229磷酸化被大幅度地提升了，这样的发现意味着也许在连续磷酸化进行到丝氨酸235时，丝氨酸229也许要被去磷酸化。由以上结果推测丝氨酸229能被动态地磷酸化与去磷酸化并且对於NS5A连续磷酸化非常重要。除此之外，229丙氨酸及229天冬氨酸突变皆会改变复制复合体（replication complex）的蛋白质（NS5A、NS3）在细胞内的分布，这样的改变可能会导致复制复合体的功能受到影响，与这样的推测相符，229丙氨酸及229天冬氨酸突变皆大幅度地降低报告病毒（reporter virus）的活性。综合以上的结果推测出丝氨酸229能被动态地磷酸化与去磷酸化，并且对於非结构性蛋白质5A的连续磷酸化以及病毒的生命周期极为重要。

并列摘要〈TOP〉

The non-structural protein 5A (NS5A) is a hepatitis C virus (HCV) protein critical to the viral life cycle. NS5A is a phosphoprotein with two phosphorylation states: hypo-phosphorylation (p56) and hyper-phosphorylation (p58) involved in HCV replication and assembly. It has been shown that p58 is a result of phosphorylation on a cluster of serine residues in NS5A low-complexity sequence I (LCS I). The serine cluster was thought to undergo sequential phosphorylation, but the phosphorylation cascade remained to be elucidated. Using antibodies specific to S232, S235, and S238, we have previously shown that S232 primes NS5A phosphorylation sequentially from S235 to S238 by casein kinase I (CKI). Notably, S229 is also located in the CKI motif (pS/T-X-X-S/T), and an in vitro kinase assay suggest that S229 phosphorylation primes S232 phosphorylation. In my thesis, we aimed to examine whether S229 is phosphorylated and whether S229 phosphorylation initiates NS5A sequential phosphorylation from S232 to S238. Phosphoablatant alanine mutation at S229 (S229A) reduced whereas phosphomimetic aspartate mutation at S229 (S229D) rescued phosphorylation of S232, S235, and S238, suggesting that S229 phosphorylation triggered NS5A sequential phosphorylation from S232 to S238. Using an S229 phosphorylation-specific antibody, we found that the level of S229 phosphorylation was quite low but detected in both p56 and p58; however, S229 phosphorylation was highly elevated in S235 phosphoablatant alanine mutant NS5A (S235A), indicating that S229 phosphorylation should be de-phosphorylated when sequential phosphorylation from S232 propagate to S235. Thus, we infer that S229 undergoes dynamic cycles of phosphorylation and de-phosphorylation that are important to NS5A sequential phosphorylation. We also found that S229A or S229D mutation altered the intracellular distribution of replication complex components (NS5A and NS3), that would interfere with the functions of the replication complex. In line with this, S229A and S229D mutation disturbed reporter virus activity. In summary, the above results suggest that S229 is crucial to NS5A sequential phosphorylation and HCV life cycle.

参考文献 ( 58 ) 〈TOP〉

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