探討轉錄所伴隨生成的R-loop之機制與調控

梁云馨

doi:10.6342/NTU.2011.03299

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探讨转录所伴随生成的R-loop之机制与调控

The Regulation of Transcription-associated R-loop Formation

梁云馨 , 硕士　　导师：李财坤　　

英文 DOI： 10.6342/NTU.2011.03299

转录； DNA拓朴异构酶活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶R圈；基因重组； RecF途径； RecA 蛋白质；类核体相关蛋白质； Transcription ； DNA topoisomerases ； Activation-induced deaminase (AID) ； R-loop ； Gene recombination ； RecF pathway ； RecA ； Nucleoid-associated proteins

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摘要 │ 参考文献 (149) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

去氧核醣核酸(DNA)进行转录时，座落於核醣核酸聚合酶(RNA polymerase)之後新转录出的核醣核酸(RNA)有时会与模板去氧核醣核酸进行配对互补，并暴露出非转录的单股DNA (single-stranded DNA, ssDNA)，这样的结构称为R-loop。近年来研究发现，免疫B细胞成熟过程中，诱发活化性胞嘧啶核苷脱氨酶(Activation-induced cytidine deaminase, AID)会对ssDNA作用，促进胞嘧啶脱氨转化成尿嘧啶，进而产生突变，而造成抗体产生多异性(antibody diversification)；因此，我们与其他实验室认为R-loop提供了ssDNA作为AID受质。此外，R-loop也作为DNA复制(replication)时的引子(primer)，然而，过度累积的R-loop也会不利於细胞存活。目前在细胞中R-loop的生成及调控机制都尚未被厘清；我们利用大肠杆菌做为操作模式系统，利用在细菌中大量表现AID来刺激产生突变。藉由在不同细菌株中产生不同的AID刺激突变倍数(AID-stimulated mutagenesis fold, ASM fold)来表示所产生R-loop的程度，以此来监别参与在其中的细胞因子。此篇论文中，我们探讨类核体相关蛋白质(Nucleoid-associated proteins, NAPs)是否参与在R-loop的形成和调控，我们发现Fis缺失的菌种其ASM倍数有降低的现象。此外，我们实验室先前发现，RecF活化的菌株(RecF-activated strain, JC7623)有极高的ASM倍数，除此之外，RecF活化的菌株也拥有许多独特的显型，例如：质体造成的死亡(plasmid-mediated lethality)、滚环状(rolling-circle)复制以及细菌丝状生长(cellular filamentation)；而这些显型都可以被额外表现的第一型拓谱异构酶(TopA)或核糖核酸酶H (RNaseH)所抑制。因此，我们认为RecF在R-loop的形成中，可能扮演了重要的角色；而为了得知R-loop调控是由RecF蛋白质或是RecF途径来参与，我们利用RecF活化JC7623细菌额外突变了RecA的菌株(JC7940)来观察这些显型是否存在。我们研究结果显示，额外突变了RecA也无法降低刺激突变倍数以及减少细菌丝状生长的现象；然而，可以稍微减缓质体造成的死亡。综合以上结果，我们认为RecF蛋白质本身对於促使R-loop的增加扮演主要的角色。此暗示了R-loop在细胞中的重要性，也找出调控此结构的分子，此有利於更进一步了解免疫细胞成熟过程中的程序与步骤。

并列摘要〈TOP〉

During transcription elongation, the nascent RNA transiently anneals with the DNA template strand behind the RNA polymerase. This RNA-DNA hybrid with a single-stranded DNA (ssDNA) region is called R-loop. Our recent results and other reports have suggested that, R-loop might serve as the substrate for activation-induced deaminase (AID) during B cell maturation and antibody dicersification. In addition, R-loop has also been suggested to function as the primer for initiation of DNA replication. Furthermore, excess amount of R-loop formed in cells might be harmful. However, the regulation of R-loop formation remains largely unclear. Here, we sought to identify cellular factors that regulate the formation of R-loop by taking advantage of the AID-stimulated mutagenesis (ASM) assay in the bacterial model system. The ASM assay was employed to further explore the contributing factors involved in R-loop formation. Our data suggested that nucleoid-associated protein Fis might be involved in the negative regulation of R-loop formation Our previous studies have shown that the ASM level was much higher in the RecF-activated strain (JC7623, recBC sbcBC) than that in the wild type strain. Moreover, the activated RecF pathway contributed to the plasmid-mediated lethality, run-away plasmid replication and cellular filamentation phenotype. Expression of AID further severed these phenotypes. All of above phenotypes could be suppressed by additional expression of functional RNase H or TopA, two identified suppressors for R-loop formation. We thus suggested that RecF may play a role in the R-loop formation rather than in the downstream recombination pathway leading to mutagenesis. Here we investigated whether and how RecF pathway or RecF itself are involved in the R-loop formation and regulation. In this regard, we examined the RecF-associated phenotype in the RecF-activated strain with additional recA mutation (JC7940, recBC sbcBC recA). Our results showed that additional RecA mutation in RecF-activated strain JC7940 cannot reduce the ASM fold, suggesting that the RecA-independence of AID-mediated recombination. The cellular filamentation is also evident in JC7940 cells. Although additional RecA mutation in JC7940 could diminish the vector-mediated lethality, the additional RecA mutation could only partially reduce the plasmid-mediated lethality in JC7940 transform with AID-expressing plasmid. We thus suggest that RecF itself plays the major role in the R-loop formation. In vitro R-loop formation assay with purified proteins were under development to provide further supports for above hypothesis. In this regard, we have successfully expressed and purified several bacterial DNA topoisomerase and RecF proteins.

参考文献 ( 149 ) 〈TOP〉

Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., and Ishihama, A. (1999). Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J Bacteriol 181, 6361-6370.
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Anderson, D.G., and Kowalczykowski, S.C. (1997a). The recombination hot spot chi is a regulatory element that switches the polarity of DNA degradation by the RecBCD enzyme. Genes & Development 11, 571-581.
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Anderson, D.G., and Kowalczykowski, S.C. (1997b). The translocating RecBCD enzyme stimulates recombination by directing RecA protein onto ssDNA in a chi-regulated manner. Cell 90, 77-86.
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Arnold, D.A., and Kowalczykowski, S.C. (2000). Facilitated loading of RecA protein is essential to recombination by RecBCD enzyme. J Biol Chem 275, 12261-12265.
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Asai, T., and Kogoma, T. (1994). D-loops and R-loops: alternative mechanisms for the initiation of chromosome replication in Escherichia coli. J Bacteriol 176, 1807-1812.
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