探討鏈黴菌線形質體SCP1上末端連結蛋白與末端蛋白中影響末端複製的胺基酸

李京儒

doi:10.6840/cycu201800049

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探讨链霉菌线形质体SCP1上末端连结蛋白与末端蛋白中影响末端复制的胺基酸

The amino acid residues of Tac and Tpc that affect the end replication of Streptomyces SCP1 linear plasmid

李京儒 , 硕士　　导师：杨千金　　

繁体中文 DOI： 10.6840/cycu201800049

链霉菌； SCP1 ；端粒连结蛋白；末端蛋白； streptomyce ； SCP1 ； terminal associated protein ； terminal protein

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摘要 │ 参考文献 (35) │ 国际计量

摘要〈TOP〉

链霉菌的染色体与部分质体呈线形。DNA复制时由中央的复制起点开始向两侧进行，当复制到末端时会在3’端留下单股缺口，端粒连结蛋白(Tap)会与缺口结合，牵引末端蛋白(TPs)作为引子，完成末端缺口的补齐。在此，Tap扮演着DNA聚合酶的角色；末端蛋白Tpg则作为引子。
    少数链霉菌质体如S. coelicolor的SCP1端粒序列及末端蛋白和大多数链霉菌有所差异，SCP1末端蛋白(Tpc)基因上游具有端粒连结蛋白(Tac)基因，与Tap及Tpg系统相似，因此也可能以相同机制进行末端的修复。我们将Tac、Tap、用蛋白质做引子的Φ29 DNA聚合酶以及具有DNA聚合酶同源性的E. coli Pol II的胺基酸序列做比对，发现有三处位置的天门冬胺酸是四种蛋白共有，其中Asp398、Asp670对应到Φ29 DNA聚合酶和E. coli Pol II与镁离子结合的位置；在Φ29 DNA聚合酶上的YCDTDS基序(motif)与其活性有关，其中的Thr具有高度保守性。本次研究目标之一是测试Tac与金属离子结合的天门冬胺酸与YCDTDS基序中的苏胺酸，将Asp398与Asp670突变成无法与二价金属离子结合的天门冬醯胺或丙胺酸；Thr669突变成丙胺酸，再以链霉菌体内实验测试，由於链霉菌要维持线形质体或染色体复制必须依靠Tac，若Tac失去活性则无法得到线形质体，pLUS894是一个能在链霉菌中维持线形复制的迷你质体，我们将三个突变後分别换入pLUS894中的tac，用限制酶AseI线形化後送到链霉菌内，抽取单株的质体，结果无法得到质体。
    Tpc对链霉菌维持线形质体或染色体也极为重要，其主要的功能为引子，可以键结在DNA上让Tac顺利进行复制。先前实验显示，在Tap与Tpg系统中，Tpg是利用亲水性高的第114个苏胺酸和DNA键结。我们利用放射性磷的dG*作为标记，Tpc为引子，Tac为DNA聚合酶进行体外补齐实验，再用二维TLC片推测Tpc可能利用丝胺酸与DNA键结，Tpc总共有13个丝胺酸，将胺基酸序列做亲水性分析，结果Ser206为Tpc上较为亲水的丝胺酸。本研究第二个目标为定位出Tpc与DNA键结的丝胺酸，先将Ser206突变成丙胺酸，再送入链霉菌做体内实验，结果无法得到线形质体；之後将突变成苏胺酸、酪胺酸以及具有咪唑的组胺酸，测试丝胺酸可否被以上胺基酸取代；另外我们也测试Ser178，将其突变成丙胺酸测试是否会有影响，若Tpc无法键结到DNA上则无法维持线形复制，将突变送入链霉菌的结果为Ser178换成丙胺酸无法得到线形质体，而Ser206换成上述三种胺基酸仍可以得到线形质体，但换成丙胺酸则无法得到线形质体，初步结果显示Tpc的Ser206可能不是与DNA键结的位置，而丙胺酸的突变可能因为其含有His-tag而失去活性；Ser178还需要做其他突变进行更明确的判断是否是Tpc与DNA结合的位置。

并列摘要〈TOP〉

Some plasmids and chromosomes of Streptomyces are linear. The replication of streptomyces proceeds bidirectionally from central origin to the end of DNA, and leaves a 3’ overhang. Next, terminal asscoiated protein (Tap) links to the 3’ overhang and recruit terminal protein (Tpg) to repair the 3' gap. In this case, Tap serves as a DNA polymerase, and Tpg serves as a primer. Some plasmids, like SCP1, have different telomeric DNA sequence that can’t align with others. The terminal asscoiated protein of SCP1 named Tac, and terminal protein named Tpc. The tac (gene of Tac) is on the upstream of tpc (gene of Tpc). This characteristic is similar to Tap-Tpg system, and therefore they may have the same mechanism of end-patching.

We align the amino acid sequence of Tac, Tap, Φ29 DNA polymerase, and E.coli DNA Pol II. The alignmet showed that there are three conservative aspartic acid residues. Two of them have been identified that are the Mg2+ binding site of Φ29 DNA polymerase and E.coli DNA pol II[1,29], and the corresponding positions in Tac are Asp398 and Asp670.The essentialty of these two residues was examined in vivo by mutating the corresponding positions in tac gene in plasmid pLUS892L, a mini linear SCP1 plasmid. The mutants of them named TacD398Q and TacD670A.The results showed that there had no linear plasmids formed. Additionally, Φ29 DNA polymerase has a motif (YCDTDS) to do with protein-primed and polymeration. The threonine is important for its activity. The essentialty of Thr669 of Tac was also tested. The in vivo results suggested that it might be critical.

The essential aminio acid residues on Tpc were also examined. We use phosphoamino acid analysis (PAA) to determine that Tpc used serine to bond to the end of DNA. There are thirteen serines in Tpc, we first check Ser206 because of its hydrophilicity. It was mutated to alanine, and named TpcS206A. The in vivo result suggested that Tpc might use Ser206 to bond to DNA end. Further, Ser206 was mutated to histidine, threonine and tyrosine. The in vivo results showed that Ser206 can be replace by those amino acid. The result of TpcS206A might be influence by his-tag, hence there had no linear plasmid formed. We also picked Ser178 to mutate to alanine then had in vivo testing. The result identicated that Ser178 can’t get any linear plasmid. There was an unecpected mutation caused by polymerase chain reaction (PCR), the His135 of Tpc mutated to tyrosine. The in vivo result that His135 might also be critical.

参考文献 ( 35 ) 〈TOP〉

1.A. J. Berman, S. Kamtekar, J.L. Goodman, José M Lázaro, Miguel de Vega, Luis Blanco, Margarita Salas, Thomas A. Steitz (2007) Structures of phi29 DNA polymerase complexed with substrate: the mechanism of translocation in B‐family polymerases. The EMBO Journal 26:3494-3505
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2.Bao, K. and S. N. Cohen (2001) Terminal proteins essential for the replication of linear plasmids and chromosomes in Streptomyces.Genes Dev 15(12):1518-27
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3.Bao, K. and S. N. Cohen (2003) Recruitment of terminal protein to the ends of Streptomyces linear plasmids and chromosomes by a novel telomere-binding protein essential for linear DNA replication. Genes Dev 17(6):774-85
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5.Bentley, S. D., Brown, S., Murphy, L. D., Harris, D. E., Quail, M. A., Parkhill, J., Barrell, B. G., McCormick, J. R., Santamaria, R. I., Losick, R., Yamasaki, M., Kinashi, H., Chen, C. W., Chandra, G., Jakimowicz, D., Kieser, H.M., Kieser, T., Chater, K. F. (2004) SCP1, a 356,023 bp linear plasmid adapted to the ecology and developmental biology of its host, Streptomyces coelicolor A3(2). Mol Microbiol 51:1615-1628.
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6.Bernad, A., Lázaro, J. M., Salas, M. and Blanco, L. (1990) The highly conserved amino acid sequence motif Tyr-Gly-Asp-ThrAsp-Ser in a-like DNA polymerases is required by phage ϕ29 DNA polymerase for protein-primed initiation and polymerization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4610-4614
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